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五种核酸提取试剂盒与猪繁殖与呼吸综合征核酸参考物质的比较

为比较不同核酸提取试剂盒对PRRSV核酸的提取效率,以国家参考物质“美国PRRSV经典菌株核酸参考物质”为模拟样品,采用试剂盒A、B、C(磁珠法)和试剂盒D、E(柱法)等5种核酸提取试剂盒提取核酸, 结果表明,5种试剂盒均可有效提取PRRSV核糖核酸,磁珠法提取效率高于柱法,试剂盒b和试剂盒c提取PRRSV核糖核酸的效率较高。 基质会影响提取效率,精液和抗凝对试剂盒的提取效率影响很大。综上所述,试剂盒B和试剂盒C均适用于猪繁殖与呼吸综合征临床样本的核酸提取。在实践中,应根据实验室条件、样品数量、样品类型和时间要求选择和应用合适的提取试剂盒。

自1995年中国爆发猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以来,该病一直伴随着中国养猪业的发展。特别是2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)的爆发,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。此后,PRRS病成为影响我国养猪业发展的主要疾病之一。从2006年到2014年,在中国猪群中流行的PRRSV病毒主要是高致病性PRRSV(惠普-PRRSV)和针对该病毒株的疫苗株。但2014年后在中国多个省份发现的NADC30样PRRSV导致PRRS疫情波动。

对于PRRSV等重大动物疾病病毒的分子生物学检测,除了检测试剂盒的特异性、灵敏度和重复性外,病毒RNA的提取也是关键环节之一,RNA的提取效率和质量直接影响最终检测结果的准确性。随着高分子材料的快速发展,RNA提取技术已经从传统的液相分离技术转变为固相载体吸附技术,如膜吸附技术和磁珠吸附技术,其中膜吸附技术(离心柱提取法)得到了广泛的应用。该方法提取率高,质量稳定,但至今未实现高通量自动化操作。磁珠吸附技术(纳米磁珠法)提取效率高,仪器自动批量提取,操作简单,目前已被许多实验室采用。

在以往的试剂比对工作中,常用已知浓度的质粒、病毒分离物和临床样品作为标准物质,但其稳定性和均匀性有限,难以保证比对试验的科学性和准确性。本研究采用国家标准物质“猪繁殖与呼吸综合征病毒美国经典株核酸标准物质”作为提取样品。参考物质稳定、均匀、准确,是定性定量测量分析的基准。可应用于检测活动的校准、评价和质量控制,从而为评价核酸提取试剂盒的提取效率提供支持。

为了优化提取效率较高的核酸提取试剂盒,本研究选取了5个试剂盒提取不同浓度的PRRSV核酸对照品,分别采用荧光逆转录聚合酶链反应和数字逆转录聚合酶链反应进行检测。通过Ct值和核酸含量评价病毒RNA的提取效率。

材料和方法

标准物质

中国动物疾病预防控制中心研制的猪繁殖与呼吸综合征病毒美国经典株:GBW(E)090930号核酸参考物质,值为(2.06±0.15)×104拷贝/μ L,保存于-20℃备用。

试剂和仪器

核酸提取试剂盒。RNA病毒提取试剂盒有五种,其中试剂盒A(进口)、试剂盒B(国产)、试剂盒C(国产)采用磁珠提取,试剂盒D(进口)、试剂盒E(国产)为手持式,购自各品牌供应商。

主试剂。PRRSV通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒,购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司;探针一步逆转录聚合酶链反应试剂盒,购自博乐公司。

比较法

RNA提取。对于试剂盒d和e,病毒RNA按照试剂盒说明书用离心柱吸附技术手工提取;另外三个试剂盒采用磁珠法,根据试剂盒说明书使用相应的核酸提取器自动提取病毒RNA。利用上述五种试剂盒,对两种浓度的PRRSV核酸对照品进行了三次平行提取,获得了30个提取产物。

荧光定量逆转录聚合酶链反应方法。根据试剂盒说明书,用PRRSV荧光逆转录聚合酶链反应反转录扩增30个提取物。用Ct值比较不同试剂盒的RNA提取效率。

一种数字化逆转录聚合酶链反应方法。采用液滴PRRSV通用数字逆转录聚合酶链反应检测方法,对30个提取产物进行逆转录扩增。通过核酸含量(拷贝/μL)比较不同试剂盒的RNA提取效率。

不同底物对核酸提取效率的影响。选择TE、抗凝、血清、血浆、扁桃体、淋巴结、肺、精液、唾液、饲料等常见底物,探讨不同底物对核酸提取效率的影响,其中组织匀浆,TE和血清直接使用。将PRRSV标准品在上述基质中稀释5倍,分别提取3次,用荧光定量聚合酶链反应和数字定量聚合酶链反应扩增。比较了试剂盒对不同基质中病毒核酸的提取效率。

结果和分析

荧光逆转录聚合酶链反应提取效果的比较

三种磁珠提取试剂盒的平均Ct值明显低于柱式便携试剂盒。提取高浓度核酸标准物质(2×104拷贝/μL)时,扩增后的Ct值顺序为B < A < C < D < E,其中试剂盒A和C提取的样品,扩增后的Ct值相近。提取浓度较低的核酸标准物质(4×103拷贝/μL)时,Ct值由低到高的顺序为C < B < A < D < E,试剂盒B和C提取的样品经扩增后Ct值相近。详见表1。

液滴数字逆转录聚合酶链反应提取效果的比较

试剂盒B和C提取的样品扩增后产物浓度相对较高,核酸提取试剂盒回收率可达98.50%以上。核酸提取试剂盒在提取高浓度核酸标准物质(2×104拷贝/μL)和低浓度核酸标准物质(4×103拷贝/μL)时回收率由高到低依次为C > B > A > D > E。详见表2。

操作比较

试剂盒D和E都是手工提取的,比较复杂耗时。A、B、C三个试剂盒,可自动或半自动提取,操作相对简单,提取RNA所需时间较少。但试剂盒C必须通过配套仪器提取,使用受限。

不同底物对核酸提取效率的影响

基于2.1-2.3的分析结果,本研究选择了试剂盒B和试剂盒C,并分析了不同底物对试剂盒提取效率的影响。结果表明,对于试剂盒B,抗凝对提取效率影响最大,其次是精液,淋巴结、TE、扁桃体等底物影响较小。对于试剂盒c,精液对提取效率影响较大,其他底物影响不大;与两种试剂盒相比,试剂盒c从抗凝、血清、饲料、唾液、扁桃体、肺、TE和血浆中提取PRRSV RNA的提取效率高于试剂盒b,从淋巴结中提取PRRSV RNA的提取效率略高于试剂盒c,从精液中提取PRRSV RNA的提取效率高于试剂盒c。

讨论

本研究选取两个柱核酸提取试剂盒和三个磁珠核酸提取试剂盒进行分析,发现五个核酸提取试剂盒都能有效提取PRRSV RNA,磁珠提取试剂盒的提取效率明显高于柱提取。三种磁珠提取试剂盒的平均回收率为96.12%,而柱提取试剂盒的平均回收率仅为41.95%。原因是PRRSV作为一种RNA病毒,不稳定,容易分解,RNase无处不在。在实际操作中,柱核酸提取试剂盒需要反复打开,加入液体,离心,使得操作更加复杂,导致RNA分解的概率更高。与两种方法相比,磁珠提取可以实现高通量和自动化,更适合高通量检测,但试剂和提取仪器的成本较高;该柱核酸提取试剂盒成本低,方法可靠,适用于少量样品的核酸提取。因此,两者的选择应根据实验室条件、样品数量和任务的紧迫性综合考虑。

在PRRS诊断方法中,核酸扩增技术更简单、更快速、更准确,感染后24小时即可检测出病毒,对PRRS的早期诊断具有重要意义。但核酸扩增检测PRRSV的检测过程复杂,涉及RNA提取、反转录、PCR扩增等多步操作。此外,样品中核酸的异质性和样品基质的多样性给标准化带来了一定的困难。PRRSV核酸标准物质的成功研制,实现了核酸提取、反转录和聚合酶链反应扩增的质量控制,在实验室检测过程中具有良好的适用性,在实验室人员操作、仪器校准等内部质量体系控制中发挥了不可或缺的作用,促进了PRRSV核酸检测的标准化。

数字化PCR可以实现绝对定量,更适合检测方法和试剂比对。在本研究中,通过荧光聚合酶链反应扩增,试剂盒A、B和C的提取效率较高,且无显著差异。通过数字聚合酶链反应,试剂盒B和试剂盒C的提取效率分别比试剂盒A高1.7倍和1.8倍,更准确地反映了试剂盒提取效率的差异。荧光RT-PCR在灵敏度和灵敏度特异性方面仍有一定的局限性,只能实现定性和半定量检测,不能准确定量病毒核酸。而液滴数字PCR通过液滴发生器将每个样品分成20000个均匀的纳米升级液滴,每个液滴作为一个独立的PCR反应器进行检测,可以计算并给出待检测目标分子的浓度或拷贝数,具有更好的准确性和灵敏度,可以更准确地比较提取试剂盒的效率差异。

不同底物对PRRSV核酸提取的影响可以通过底物稀释标准物质得到一定程度的反映,但不能完全模拟感染动物组织中的PRRSV核酸提取,只能为实验室人员从不同底物中提取PRRSV核酸时选择试剂盒提供参考。

五种试剂盒均可有效提取PRRSV RNA,磁珠法提取效率高于柱法,试剂盒b和试剂盒c提取PRRSV RNA的效率较高。基质会影响提取效率,精液和抗凝对试剂盒的提取效率影响很大。综上所述,试剂盒b和试剂盒c均适用于从PRRSV临床样品中提取核酸。在实践中,应根据实验室条件、样品类型、样品数量和时间要求选择和应用合适的提取试剂盒。

五种核酸提取试剂盒与猪繁殖与呼吸综合征核酸参考物质的比较